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Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, la insulina se libera en el entorno extracelular bien mediante la secreción de insulina soluble por article source célula o mediante el anclaje de las moléculas de insulina a moléculas de la superficie celular.

También debe entenderse que las células objeto, antes de experimentar la células melligen para tratar la diabetes genética de la presente invención, pueden haber experimentado alguna otra forma de tratamiento o manipulación, tal como pero no limitado a enriquecimiento o purificación, modificación del estado del ciclo celular o la formación de una línea celular. De acuerdo con esto, la célula objeto puede ser una célula primaria o una célula secundaria. Una célula primaria es una que se ha aislado de un individuo.

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Una célula secundaria es una que, después de su aislamiento, ha experimentado alguna forma de manipulación in vitro antes de la manipulación genética de la presente invención.

La célula objeto es un hepatocito. Sin limitar la presente invención células melligen para tratar la diabetes ninguna teoría o modo de acción, se sabe que los hepatocitos juegan un papel crucial en el metabolismo intermedio, síntesis y almacenamiento de proteínas en el hígado.

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Esto es, la capacidad de respuesta a glucosa objeto no es tal que se induzca un estado fisiológicamente inaceptable de hipoglucemia. Debe apreciarse, por lo tanto, que este intervalo de concentración puede variar de un mamífero a otro.

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En el contexto de los seres humanos, el intervalo de concentración de glucosa relevante es aproximadamente mM de glucosa. Esto incluye, por ejemplo, todas las isoformas que surgen de corte y empalme alternativo del ARNm que codifica estas moléculas o mutantes funcionales o variantes polimórficas de estas proteínas.

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Preferiblemente, el mamífero es un ser humano o primate. Los "derivados" de las moléculas descritas en la presente memoria por ejemplo, insulina, GLUT 2, transportadores de glucosa en células melligen para tratar la diabetes, glucoquinasa y semejantes incluyen fragmentos, partes, porciones o variantes funcionales. Por ejemplo, la insulina o derivado de ésta puede fusionarse con otra molécula con el fin de tener un efecto agonista de su actividad.

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En otro ejemplo, puede ser deseable facilitar la co-expresión tanto de proinsulina como una enzima de escisión. Una "variante"debe entendersequesignificauna moléculaque presentaalmenos parte de la actividad funcionalde la forma de la molécula de la que es una variante.

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Una variación puede tener cualquier forma y puede ser natural o no natural. En el contexto de la insulina, por ejemplo, se podía utilizar el gen de la insulina de un mamífero no humano, incluso cuando se propone utilizar las células de la invención en un contexto humano. Esta modificación genética puede ocurrir en uno o ambos de células melligen para tratar la diabetes contextos.

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En primer lugar, la célula puede haberse modificado genéticamente con el fin de convertirla en "capaz link secretar insulina".

De acuerdo con esto, por "modificada genéticamente" se quiere decir que la célula objeto ha experimentado alguna forma de células melligen para tratar la diabetes molecular respecto a la que se observa en el contexto de la mayoría de una población no modificada correspondiente.

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Para este fin, el término "expresión" se refiere a la transcripción y traducción de ADN o traducción de ARN que resulta en la síntesis de un péptido, polipéptido o proteína. Una construcción de ADN, por ejemplo, corresponde a la construcción que se puede buscar para transfectarla en una célula para la expresión posterior mientras un ejemplo de una construcción de ARN es la molécula de ARN transcrita a partir de la construcción de ADN, construcción de ARN que sólo requiere la traducción para generar células melligen para tratar la diabetes proteína de interés.

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El término "proteína" debe entenderse que engloba péptidos, polipéptidos y proteínas. También debe entenderse que estos términos se usan indistintamente en la presente memoria.

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Por ejemplo, el material genético generalmente se introduce convenientemente en las células mediante el uso de una construcción de expresión.

Alternativamente, se puede buscar usar, como la población celular de partida, un tipo celular que bien naturalmente ocomo un resultado demanipulación genética bien aleatoria o dirigida anteriorse caracteriza poruna.

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El promotor objeto puede ser constitutivo o inducible. La construcción objeto puede diseñarse adicionalmente para facilitar el uso del sistema de expresión génica inducible porcorte y empalme mediado por la recombinasa Cre.

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La molécula de ARN se transcribe a partir de ésta. En general, las construcciones de expresión también se refieren por varios términos alternativos, términos que se utilizan ampliamente indistintamente, incluyendo "casete de expresión" y "vector". La construcción de expresión de la presente invención puede generarse por cualquier método adecuado incluyendo técnicas recombinantes o sintéticas.

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Para este fin, la construcción objeto puede construirse desde el principio, como ocurriría cuando se utiliza una estrategia completamente sintética, o puede construirse modificando apropiadamente un vector existente.

Los bacteriófagos son virus que infectan y se replican en bacterias. Éstos son cualquiera de un grupo de virus con ADN que células melligen para tratar la diabetes se multiplican en invertebrados y generalmente se clasifican en la familia Baculoviridae. Su genoma consiste en ADN circular bicatenario.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación, no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento.

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La construcción de expresión que se usa en la presente invención puede ser de cualquier forma incluyendo circular.

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En este contexto, una secuencia de nucleótidos "circular" debe entenderse como una referencia a la parte de secuencia de nucleótidos circulardecualquiermoléculadenucleótidos. En este contexto, la secuencia de nucleótidos "circular" corresponde a la parte circular de esta molécula.

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La secuencia lineal puede ser una molécula de nucleótidos lineal o puede ser una parte lineal de una molécula de nucleótidos que también comprende una parte no lineal tal como una parte circular. Para este fin, debe entenderse que la configuración de la construcción de la presente invención puede o no permanecer constante.

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Sin embargo, en otro ejemplo, la construcción objeto puede ser una que se transfecta en una célula en forma circular pero experimenta linearización intracelular antes de la integración cromosómica. Ésta no es necesariamente una situación ideal ya que dicha linearización puede ocurrir de una manera aleatoria y escinde potencialmente la construcción en una región crucial convirtiéndola de esta manera en células melligen para tratar la diabetes.

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Por ejemplo, una construcción que células melligen para tratar la diabetes en ADN derivado esencialmente de bacterias o virus puede expresarse no obstante en las células madre de mamíferos contempladas en la presente memoria. Debe entenderse que el vector de expresión ejemplificado en la presente memoria sólo se proporciona como ejemplo y no se pretende que limite de ninguna manera el rango y diseño de vectores que podrían usarse para conseguir el objeto de la presente invención.

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La detección de proteínas específicas, tales como proteínas de la superficie celular o proteínas intracelulares por ejemplo, insulina, GLUT 2, glucoquinasa etc. Brevemente, se incuban anticuerpos marcados fluorescentemente en células fijadas para detectar marcadores cardiacos específicos.

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Alternativamente, pueden emplearse técnicas tales como inmunotransferencia Western o micro matrices de hibridación "chips de proteína". Alternativamente, otros métodos que pueden usarse incluyen micromatriz de hibridación "chip de ARN" o transferencia Northern o transferencia Southern.

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Puede usarse RT-PCR para detectar ARN específicos que codifican esencialmente cualquier proteína, tal como las células melligen para tratar la diabetes detalladas en el punto ii anterior, o proteínas que se secretan o que de otra forma no son detectables convenientemente mediante la metodología detallada en el punto ii. Por ejemplo, en la medida en que se busca establecer la existencia de un sistema sensor de glucosa funcional, puede evaluarse la producción de insulina de una célula de la invención en presencia de niveles variados de glucosa extracelular.

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Como se ha detallado anteriormente en la presente memoria, la célula modificada de la presente invención es un hepatocito, siendo éste un tipo celularque podría decirse que requiere menos modificación para convertirlo en capaz de secretar insulina que otros tipos celulares debido al hecho de que expresa de manera inherente el transportador de glucosa de alta capacidad, GLUT 2.

De acuerdo con esto, células melligen para tratar la diabetes desarrollos de la presente invención son una etapa significativa hacia adelante ya que superan este problema.

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Se piensa queestas células presentan un desequilibrio en la proporción glucoquinasa:hexoquinasa a favor de las hexoquinasas lo células melligen para tratar la diabetes resulta en un flujo glicolítico aumentado a niveles bajos de glucosa y consecuentemente sensibilidad incrementada de la respuesta de secreción de insulina estimulada por glucosa.

De acuerdo con esto, la referencia a una afección patológica "caracterizada por la producción aberrante de insulina funcional" debe entenderse como una referencia a cualquier afección, un síntoma o causa de here cual es niveles insuficientes o inadecuados de insulina funcionalmente efectiva.

La referencia a "diabetes" debe entenderse como una referencia a una afección en la que se producen niveles insuficientes células melligen para tratar la diabetes insulina para mantener click de glucosa biológicamente normales.

El término "tratamiento" no implica necesariamente que un mamífero se trate hasta la recuperación total. De acuerdo con esto, tratamiento y profilaxis incluyen la mejora de los síntomas de una afección particular o prevenir o reducir de otra forma el riesgo de desarrollar una afección particular.

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El término "profilaxis" puede considerarse como reducir la gravedad del inicio de una afección particular. El "tratamiento" también puede reducir la gravedad de una afección existente.

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La presente invención debe entenderse por lo tanto que engloba prevenir, reducir o mejorar de otra forma la diabetes en un mamífero. Por ejemplo, el método de la presente invención puede normalizar bien completamente o parcialmente los niveles de glucosa en un individuo diabético.

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Sin embargo, debe entenderse que la presente invención se extiende no obstante al uso de células derivadas de cualquier otra fuente adecuada en el que las células células melligen para tratar la diabetes presentan el mismo perfil de histocompatibilidad mayor que el individuo que es elsujeto de tratamiento.

Dichas células debe entenderse que se encuentran en la definición de "autólogas".

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Las células también pueden haberse modificado por ingeniería para presentar el perfil de histocompatibilidad mayor deseado. El uso de dichas células supera las dificultades que se encuentran de manera inherente en el contexto de trasplantes de tejido u órgano.

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Sin embargo, cuando no es posible o factible aislar o generar células autólogas, puede ser necesario utilizar células alogénicas. También se contempla en la presente memoria el uso de líneas celulares establecidas tales como Huh7ins o las células Melligen que se han derivado de ellas.

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La presente invención también debe entenderse para extenderse al trasplante xenogénico. Esto proporciona un medio para seleccionar una subpoblación de células específica para administración, tal como células que expresan niveles apropiados de la insulina y moléculassensoras de glucosa en cuestión.

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En el contexto de este aspecto de la presente invención, las células objeto requieren la introducción en el individuo objeto. Para este fin, las células pueden introducirse por cualquier método adecuado. Las células también pueden encapsularse antes del trasplante.

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La administración mediante inyección puede estar dirigida a varias regiones de un tejido u órgano, dependiendo del tipo de tratamiento requerido. Por ejemplo, puede ser necesario co-administrar la enzima PC2 o PC3 para facilitar la escisión de proinsulina a insulina. Debe entenderse que una molécula que puede modularse "directamente" por la insulina es una con la que la insulina objeto se asocia o interacciona de otra manera para regular al alza, regular a la baja o modular de otra forma su actividad funcional células melligen para tratar la diabetes niveles o para alterar de cualquier manera sus características estructurales u otras fenotípicas, moleculares u otras características físicas.

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Un equipo de investigadores de la Universidad de Washington en St. Louis EE. Millman, autor de la investigación.

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Millman formó parte de un equipo de investigación que, en células melligen para tratar la diabetes, convirtió las células de la piel en células madre y, enhizo lo mismo con las células de la piel de un paciente con diabetes. En cada ocasión, las células madre se trataron con diferentes factores de crecimiento para persuadirlas a células beta secretoras de insulina.

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Una vez que se completó el proceso, los investigadores trasplantaron las células beta en ratones diabéticos con su sistema inmunitario suprimido para que no rechazaran las nuevas células.

En cualquier caso, este experto considera que si se demuestra que las células beta derivadas de células madre son seguras y células melligen para tratar la diabetes para las personas diabéticas, la fabricación de las células podría acelerarse y llegar a una escala industrial.

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  3. La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación, no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento. La diabetes mellitus se caracteriza por una anormalidad en el metabolismo de carbohidratos que resulta en niveles de glucosa elevados tanto en sangre como en orina.
  4. Pero hay un desafío importante: la cantidad de insulina producida por estas células es difícil de controlar.

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